小囊泡sEVs/外泌体exosomes目前开展得如火如荼，从所周知，细胞外囊泡不止有小囊泡，还有大囊泡，大囊泡有什么样特征，是否具有功能性呢？如何研究？是否能作为标志物来源？下面小恩将对大囊泡进行系统阐述。

首先，细胞外囊泡EVs的类型如下表所示：

1）大家熟知的小囊泡/外泌体sEVs/exosomes，大小在30-nm，离心力约为Kg；

2）大小在-0nm的大囊泡/微囊泡lEVs/microvesicles(MV)/ecotosomes/microparticles(MP)，离心力约为10Kg；

3）大小在0.8-5.0μm的凋亡小体Apoptoticbodies(ABs)，离心力约为2Kg。

Ref1：Extracellularvesiclesinthetumormicroenvironment:oldstories,butnewtales.MolCancer.Mar30;18(1):59.doi:10./s---8.PMID:;PMCID:PMC.

Section1微囊泡生物发生

作为细胞外囊泡的明星的外泌体，大家对它的生物发生过程耳熟能详。

下图中左侧为外泌体形成过程：跨膜蛋白（红色）被内吞并运输到早期内体（earlyendosome），一旦分选到晚期内体（lateendosome），运输所需的内体分选复合物ESCRT-0募集泛素化的蛋白质，随着胞质内核酸和蛋白等一些“货物”的进入，ESCRT-I和-II介导内腔囊泡（intraluminalvesicles，ILVs）的出芽。并逐渐演变成多泡体（multivesicularbody，MVB），MVB可以遵循与溶酶体（橙色）融合的降解途径，也可以通过囊泡步骤将ILV作为囊泡释放到细胞外空间，形成外泌体。（关于外泌体的基本介绍，参考“系列之——外泌体简介”?。）

那么微囊泡是如何形成的呢？见上图的右侧部分：胞吐方式，在质膜成核Nucleation过程中，跨膜蛋白（红色和蓝色）聚集在离散的膜结构域中，从而促进膜向外出芽。四跨膜蛋白和其他蛋白质可能通过促进其他成分的分选而发挥作用。蛋白质的脂质锚（肉豆蔻酰化，棕榈酰化）（绿色）会在管腔中积聚蛋白质，并导致膜弯曲。ectosomes形成的其他机制包括Ca2+活化的磷脂拼接酶scramblases（红色矩形），它使脂质在质膜两个表面之间的分布随机化。细胞骨架（浅灰色）变得更松散，而胞质蛋白和RNA分子（浅蓝色）则被分选进入ectosomes。招募的TSG（粉色）是ESCRT-I复合物的成员，它介导ESCRT-III（鲑鱼亚基）募集到质膜，从而促进ectosomesspiral的组装。特定的ATPaseVPS4（橙色）通过拉动ectosomesspiral末端来介导ectosomes的拆卸，以游离形式进入胞外。

Ref2：CocucciE,MeldolesiJ.Ectosomesandexosomes:sheddingtheconfusionbetweenextracellularvesicles.TrendsCellBiol.Jun;25(6):-72.

Section2微囊泡表征

1、电镜下形态

14年发表在TrendsMolMed的这篇综述中认为，电镜下外泌体具有经典的清晰膜状茶托样（一侧半凹陷）结构，而大囊泡和凋亡小体在电镜下则形状多样，具有异质性。

Ref3：VaderP,BreakefieldXO,WoodMJ.Extracellularvesicles:emergingtargetsforcancertherapy.TrendsMolMed.Jul;20(7):-93.

2、Ectosomes和exosomes综合比较

15年发表在TrendsCellBiol的这篇综述对二者进行了系统比较如下所示：

两种囊泡似乎均是疾病尤其是癌症的诊断和治疗中有希望的靶标。

关于大小囊泡的marker，仅展示了各2个蛋白，外泌体为CD63和CD61，而大囊泡为TyA和C1q。作者认为其他蛋白在不同细胞类型来源以及相同细胞类型不同条件下EV中具有差异和变化，因此未予以展示。

Ref2：CocucciE,MeldolesiJ.Ectosomesandexosomes:sheddingtheconfusionbetweenextracellularvesicles.TrendsCellBiol.Jun;25(6):-72.

3、蛋白质组定义新的marker以表征细胞外囊泡异质性亚群

年，有学者对人类树突状细胞条件培养基，通过差速离心得到10K和K囊泡沉淀，后续进行碘克沙醇梯度离心或免疫捕获进一步对囊泡进行亚群分类，对不同亚群进行了蛋白质组学解析各亚群特异性marker。结果发表在PNAS杂志。

左上：差速离心获得大小囊泡；右上AB：大小囊泡碘克沙醇梯度离心进一步分亚群；下图AB：K小囊泡进一步进行免疫捕获分亚群。

各囊泡亚群表征：1）所有EVs中都存在几种经典使用的外泌体标记物，例如主要的组织相容性复合物MHC、Flotillin-1和HSC70蛋白。

2）不同类型的EVmarker如下图所示，其中加粗字体为经过WB验证的蛋白，不加粗为蛋白质组学筛选结果；EV被示意为包裹细胞质（浅色背景）的脂质双层（棕色粗圆圈）；棕色：几种类型EV共享的蛋白质；绿色：特异富集于F3-K的蛋白质（即轻密度sEV），包括富含四跨膜蛋白的内体来源的外泌体（斜体）的特异性蛋白（如CD63、CD81、TSG、Syntenin-1等），以及所有sEV中普遍存在的蛋白(如ADAM10、AnnexinXI等)。灰色：与sEV（K沉淀）共分离但在较高密度（F5-K）的sEV中的蛋白质。蓝色：在大囊泡中特别富集的蛋白质（如GP96、Mitofilin、Actinin-4等）。

Ref4：Proteomic