摘要

建立了基于肉豆蔻酸异丙酯作为破乳剂的一种禽流感油乳剂疫苗抗原快速检测方法，环保价廉，实验条件简易，可在数小时内准确快速测定禽流感等油乳剂疫苗成品抗原HA效价及分析其抗原性差异，方便广大养殖用户从不同来源疫苗中有针对性地选择优质高效的疫苗，并在使用疫苗前确定其抗效价，避免使用低效价疫苗，确保预期防控效果；同时也方便兽药监察部门对市场上各个厂家的禽流感油乳剂灭活疫苗质量进行实时监测。

关键词：禽流感；油乳剂疫苗；抗原质量；评价方法

禽流感在全世界范围内的流行给养禽业以严重打击，同时也对公共卫生事业构成重大威胁。接种油乳剂灭活疫苗被证实是用于禽流感等疫情预防和控制的有效方法。但事实上，近几年来免疫监测的结果显示，仍有不少免疫群体抗体合格率较低，在一些免疫禽群体中仍然可以分离到病毒。究其主要原因，可能是疫苗本身所含抗原效价不高，或者是由于运输保存等条件的限制导致抗原衰减，此外，流行毒株抗原性与疫苗株差异较大也可能导致疫苗免疫保护效果不理想。因此，灭活疫苗所含抗原质量的优劣直接影响到了疫病防控效果。

目前，对于禽流感油乳剂灭活疫苗质量的检测，主要由生产厂家按照国家相关要求与规程进行质检。由于疫苗质量标准中规定效检必须免疫SPF鸡，对动物与实验设施要求较高，需要SPF动物房及专用隔离器，而且耗时长（21天以上）、资金花费大，多数生产厂家只能进行少数的抽检。多数养禽业疫苗用户没有相关的检测能力，只能通过对禽群免疫接种后的抗体检测情况和保护情况来衡量实际免疫效果。

本研究旨在建立一种禽流感油乳剂疫苗抗原快速检测方法，其在简单的实验条件下即可进行，无需将疫苗免疫SPF实验鸡，试剂廉价环保，可在数小时内准确快速测定禽流感等油乳剂疫苗成品抗原HA效价及分析其抗原性差异，方便广大养殖用户从不同来源疫苗中有针对性地选择优质高效的疫苗，并在使用疫苗前确定其抗效价，避免使用低效价疫苗，确保预期防控效果；同时也方便兽药监察部门对市场上各个厂家的禽流感油乳剂灭活疫苗质量进行实时监测。

1　材料

1.1　疫苗抗原、抗体

H9亚型禽流感病毒DA株、YS株灭活后胚液抗原、H9亚型禽流感DA株、YS株阳性血清及检测抗原均由肇庆大华农生物药品有限公司农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室提供，4℃保存备用。

1.2　试剂

肉豆蔻酸异丙酯购自国药集团化学试剂有限公司，司本、吐温、白油、pH7.2、0.01mol/L等渗磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）、1%鸡红细胞悬液等均由肇庆大华农生物药品有限公司提供。

1.3　试验器材

游涡振荡器、离心机以及血凝微量反应板、离心管、可调加样器等试验耗材均由肇庆大华农生物药品有限公司提供。

2　方法

2.1　含不同HA价抗原水相的禽流感油乳剂灭活疫苗的制备

用H9亚型禽流感DA株检测抗原测定DA株灭活后胚液的HA效价，分别用适量PBS缓冲液稀释到HA效价分别为9log2、8log2、7log2、6log2，分别将这些抗原按照同一油水比例配方和乳化工艺制备4组油乳剂疫苗，编号依次为1～4。

2.2　乳化前和破乳后抗原水相HA效价比较

室温环境下，取步骤2.1中编号为1～4的疫苗各10mL，分别放入50mL离心管中，加入5mL肉豆蔻酸异丙酯，置于游涡振荡器剧烈振荡5min以上，以rpm转速进行离心5min，可见油、水分离；用移液器小心吸出离心管底部的水相层约3mL，按照中华人民共和国国家标准（GB/T-）所述血凝（HA）试验方法，对4份水相进行HA效价检测。

2.3　疫苗破乳所得水相抗原用于测定阳性血清HI抗体价比较

取步骤2.2中测定HA价的破乳后水相抗原，分别配制成的4HAU的抗原，按照中华人民共和国国家标准（GB/T-）所述血凝抑制（HI）试验方法对同一批次的H9亚型禽流感DA株、YS株疫苗阳性血清进行HI测定。设H9亚型禽流感DA株、YS株检测抗原作为对照。

3　结果

3.1　乳化前和破乳后抗原水相HA效价比较

1～4组的疫苗各10mL，加入5mL肉豆蔻酸异丙酯，置于游涡振荡器剧烈振荡5min，以rpm转速进行离心5min即可见各组出现明显的油、水分离，底层的水相均约为4mL。对上述破乳后析出的4份水相进行HA价检测，HA效价见表1，可见测得的疫苗破乳前后抗原水相HA效价完全一致。说明本方法处理不影响油乳剂疫苗中HA蛋白的血凝活性及其浓度，可用于下一步对疫苗内抗原水相HA的直接测定。

表1　乳化前和破乳后抗原水相HA效价

3.2　疫苗破乳所得水相抗原用于测定阳性血清HI抗体效价比较

由表2可知，将不同配方组DA株疫苗按本法破乳获得的水相分别制备4HAU抗原，测定不同株H9禽流感疫苗阳性血清的HI抗体效价结果均与使用DA株检测抗原检测的结果一致，说明本方法处理不影响油乳剂疫苗水相中HA蛋白的抗原性，不干扰HI抗体与HA抗原的结合，可直接用于配制HI检测用4HAU抗原。

已报道疫苗毒株DA株与YS株的HA基因核苷酸相似性仅为93.5%，其序列在分子进化关系上分别属于H9禽流感病毒的不同谱系分支，由表2可知，两株毒的交叉HI价有3log2的差异，而禽流感免疫血清对与其免疫原抗原性一致的4HAU抗原HI效价最高。说明本方法还可以用于快速比较疫苗成品所含抗原与疫苗标准抗原或者流行毒株抗原性差异。

表2　疫苗破乳所得水相抗原用于测定H9禽流感阳性血清

HI抗体效价

4　讨论

禽流感油乳剂灭活疫苗的生产过程是将灭活病毒抗原水相与白油等佐剂乳化制成稳定的油包水(W/O)油乳剂疫苗。只有疫苗中含有足够的HA抗原，才能保证其免疫后产生足够的抗体水平。此外，不同谱系毒株抗原性差异大，诱导的中和抗体通常难以有效交叉保护。免疫疫苗或感染病毒后的血清抗体只对相应谱系的抗原具有最高的HI滴度。以上这些特点为评价疫苗质量提供了重要的理论依据。

有报道用三氯甲烷作为破乳剂进行禽流感油乳剂灭活疫苗HA的效价检测，该方法存在以下几点弊端：1、三氯甲烷可使蛋白质变性，损害HA蛋白抗原性，影响HA效价的准确度；2、三氯甲烷在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气，不易安全存放；3、三氯甲烷作用于中枢神经系统，对心、肝、肾有损害，对人体具有致癌、致畸、致突变性；4、三氯甲烷对环境有危害，对水体可造成污染。还有报道利用有机溶剂苯甲醇、正戊醇、正己醇作为口蹄疫苗破乳剂，但这些有机溶剂也都存在有毒易燃、可使蛋白变性等影响HA效价直接测定的弊端。

相比之下，本研究方法选用破乳剂肉豆蔻异丙酯本身为化妆品级表面活性剂，对人体和环境安全无毒害且价廉易取，不改变水相HA效价与抗原性，简便迅速，对仪器设备与试剂要求低，分离出的水相可以直接用于进行HA、HI效价测定，进而快速比较疫苗成品所含抗原与疫苗标准抗原或者流行毒株抗原性差异。

本方法具有很强的推广性，特别适合于广大养殖企业用户从不同来源疫苗中有针对性地选择优质高效的疫苗，并在使用疫苗前确定其抗原效价，避免使用低效价疫苗，确保预期防控效果，同时也方便兽药监察部门对市场上各个厂家的禽流感油乳剂灭活疫苗质量进行实时监测。

参考文献：略

（本文摘自《第26届广东省科技进步活动月畜牧兽医学术与产业创新发展大会论文集》，作者：赖汉漳、王小芬、盘伟岚、陈华坚、陈培军、麦康聪、徐家华、陈瑞爱，工作单位：广东温氏大华农生物科技有限公司）

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