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摘要

顺-冷杉醇是一种天然二萜类化合物，是用作半合成公认的龙涎香的替代品(?)-降龙涎香醚的起始材料，植物中顺-冷杉醇的生物合成涉及(E,E,E)-香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的连续环化，被二萜合酶(diTPS)进一步转化为二萜。其合成来自两种结构单元异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），可通过古细菌/真核生物中的甲羟戊酸（MVA）途径和原核生物中的甲基-D-赤藓糖醇-4磷酸(MEP)途径合成。通常大肠杆菌中只有MEP途径，近年来代谢工程已被用来在大肠杆菌中构建MEP和/或MVA途径来生产二萜类化合物。Sallaud等人已经鉴定并表征了烟草中顺-冷杉醇生物合成的两个diTPS基因，II类冷杉醇合酶(NtTPS2)和I类二萜合酶(NtABS)。此外，Zerbe等人从香脂冷杉中发现了一种双功能I/II类顺-冷杉醇合酶(AbCAS)，同时包含I类和II类活性位点和功能，AbCAS可以直接将GGPP转化为顺-冷杉醇。来自南京农业大学的李迅老师团队在“JournalofAgriculturalandFoodChemistry”期刊上发表的文章《CombinatorialEngineeringofMevalonatePathwayandDiterpenoidSynthasesinEscherichiacoliforcis-AbienolProduction》中在大肠杆菌中加强了MEP途径，并将MVA途径导入到大肠杆菌中。在此基础上，对不同来源的几种顺-冷杉醇合酶进行了筛选和优化，以获得较高的顺-冷杉醇产量，最后对培养条件进行了优化，并且为提高单相培养中产物效价和解决两相生物发酵中乳化现象对不同溶剂进行研究。

内容

1.设计MEP和MVA途径以生产顺-冷杉醇由于细胞内NAD(P)H和ATP的平衡，MVA和MEP途径的共表达可进一步提高产物产量。作者研究了与MEP和MVA途径相关的三株大肠杆菌CA、CA、CA，如图1a所示，具有原始MEP途径的菌株CA的顺-冷杉醇滴度在24h后为3.5mg/L，而具有强化MEP途径的菌株CA的顺-冷杉醇滴度增加到15.4mg/L，随后，含有质粒pMUD、pMLIE和pGNC的菌株CA产生了.2mg/L的顺-冷杉醇，与菌株CA相比增加了7倍。顺-冷杉醇的生成可能会影响其生长表型和葡萄糖消耗。MVA途径的引入对培养过程中的细胞生长影响不大，所有菌株的OD均在10.0左右。菌株CA和CA的葡萄糖消耗率比CA快，菌株CA产生的的顺-冷杉醇产量达到0.g/g葡萄糖，远高于CA和CA的产量，具有原始MEP途径和MEP途径过表达菌株的顺-冷杉醇产率分别达到0.mg/L/h和0.36mg/L/h，而这两个途径的过表达使顺-冷杉醇产率提高到2.68mg/L/h。因此，MEP和MVA途径的过表达显著改善了大肠杆菌中的顺-冷杉醇的合成。

2.优化不同的顺-冷杉醇合酶组合以生产顺-冷杉醇

在本研究中，作者将三种diTPS（来自N.tabacum、C.forskohlii、和S.sclarea)、AbCAS和NtABS基于大肠杆菌的首选密码子使用进行收集、优化和合成。CAS、diTPS和ABS之间存在分子相互作用，因此作者选择一系列具有这些蛋白质融合或单独或多表达的组合变体。携带NtTPS2和NtABS模块的菌株CA产生4.1mg/L的顺冷杉醇，而携带双功能冷杉醇合酶AbCAS模块的菌株CA产生9.0mg/L顺-冷杉醇，是CA产量的2倍以上。因此构建了更多使用AbCAS的变体，得的菌株CA、CA和CA分别可以产生91.9、.7和.7mg/L的顺-冷杉醇，产量有了很大提高，这些结果表明，AbCAS与SsTPS2的组合比其他diTPS更有效，同时与单独使用AbCAS的菌株相比，具有AbCAS和diTPS2模块的菌株（CA、CA和CA）将顺-冷杉醇滴度提高了10倍以上。根据前人研究表明，不同的diTPS的融合会使活性位点更接近，于是构建了融合蛋白AbCAS-L-NtTPS2、NtTPS2-L-NtABS和NtABS-L-NtTPS2，产生菌株CA0、CA0、CA，发现顺-冷杉醇产量急剧下降，表明该类杂合酶不能在宿主中正常表达，表明蛋白融合的方法不适用。

3.诱导条件对顺-冷杉醇生产的影响

诱导温度、诱导剂浓度及其加入时间都会影响菌株的生长和重组蛋白的表达。当诱导温度从35℃降低到25℃时，CA中顺-冷杉醇的产量显著提高，48h后达到±0.3mg/L，诱导温度过高(30℃和35℃)或过低(20℃)都会影响产量。当IPTG浓度为0.5mM时，顺-冷杉醇的产量达到.8mg/L，而高(1.0mM)或低(0.1mM)浓度的IPTG会降低其产量。在添加IPTG时，最佳OD为5，顺-冷杉醇滴度达到±0.4mg/L，当菌株CA在早期对数期被诱导时，顺-冷杉醇的产量没有显著差异，然而当在OD为7时诱导，顺冷杉醇的产量显著下降。过晚的诱导时间点会导致细胞过多和碳源不足，从而导致产量低。研究者还研究了不同初始培养基pH(5.5?7.0)对产量的影响，确定了最适初始pH为6.5。

当本研究的初始pH为6.5时，发酵液的pH大部分时间都保持在6.0左右，顺-冷杉醇的滴度呈上升趋势(图4e)。24h后葡萄糖几乎耗尽，而乙酸在整个培养过程中仅累积到1.5g/L以下，顺-冷杉醇在48h后的最终滴度达到mg/L。

4.两相生物过程（TPB）中的顺-冷杉醇生产

微生物生产高滴度的萜类化合物可能会对其产生毒性，当顺-冷杉醇以外源方式添加到生长培养基中时，它对大肠杆菌的毒性很低甚至没有。尽管顺-冷杉醇对大肠杆菌几乎没有抑菌活性，但其滴度（41.1mg/L）在单相培养中较低，TPB可通过缓解终产物反馈抑制来提高顺收率。顺-冷杉醇生物合成实验的结果显示TPB发酵中存在自发乳化现象，为了获得TPB的成功应用，选择合适的溶剂很重要。因此作者研究了正十二烷、油醇和肉豆蔻酸异丙酯对菌株CA的生长和顺-冷杉醇生产的影响，并以无溶剂培养作为对照。在正十二烷、油醇和肉豆蔻酸异丙酯的存在下，顺-冷杉醇的滴度分别达到.8、.8和.9mg/L，分别是无溶剂培养的4倍、3.2倍和3.5倍，此外双相培养中的细胞生长也没有明显的下降。顺-冷杉醇在以肉豆蔻酸异丙酯（0.g/g）为溶剂的时DCW最高且其作为溶剂也减轻了乳化作用，因此作者选择肉豆蔻酸异丙酯作为TPB溶剂。重组菌株CA在对照条件下采用补料分批发酵方式在1.3L发酵罐中培养，使用肉豆蔻酸异丙酯覆盖层进行。顺-冷杉醇产量在96h内达到最大值.7mg/L，相应的比产率为6.6mg/L/h。

总结

研究者将MEP途径和MVA途径在大肠杆菌中进行了改造，表达顺-冷杉醇合酶的优化版本，对诱导条件进行优化，以及使用两相培养的方法提高了顺-冷杉醇的产量。

殷明雪摘译

合成生物制造工程


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