RDstage:PhaseII(NCT).

Indication:Chronicmyelogenousleukemia.

Target:AllostericInhibitionoftheTyrosineKinaseActivityofBCR-ABL1.

Interactiontype:Allostericinhibitor

图一左为正常染色体，右边为异常染色体

在年，工作于美国费城的宾州大学病理系的教授彼得·C.诺埃尔和他的学生大卫·亨格福德发现了一个非常有趣的现象，即慢性粒细胞白血病患者的第22号染色体比正常人的要短一小段。他们敏锐地意识到这也许就是慢性粒细胞白血病发作的原因。后来的实验证明这些慢性粒细胞白血病肿瘤细胞确实是从发生染色体变异的单个细胞生长而成，而这一短小的染色体也就以两位研究者所在地费城命名，即费城染色体。直到年，芝加哥大学的珍妮特·戴维森·罗利用优化的染色法研究慢性粒细胞白血病患者的染色体时发现，原来费城染色体所缺失的那一小段，从22号染色体的长臂易位到了9号染色体上。这一发现首次在人类癌症细胞上证明了染色体易位的发生。

图二费城染色体

年，科学家通过进一步研究发现，费城染色体形成时，原来9号和22号染色体断裂点上，各含有一个基因，分别是9号染色体上的ABL基因和22号染色体上的BCR基因。费城染色体易位形成后，打断了这两个原有的基因，同时又组合成了新的BCR-ABL“融合基因”，BCR-ABL“融合基因”的发现，证实了基因融合的存在性。同时在在肿瘤研究中具有非常重要的科学意义，因为针对基因融合所开发的治疗癌症的药物，转变了原有的癌症治疗方式，为癌症患者提供了更为精准的、靶点的、个体化的治疗方案。

图三基因融合的几种类型

基因融合是指两个基因的全部或一部分序列相互融合为一个新的基因的过程，其原因有可能是染色体易位、中间缺失或染色体倒置，通常具有致瘤性。费城染色体中的BCR-ABL融合基因编码一种分子量是kD的蛋白质（P），这种蛋白质有增强的酪氨酸激酶活性，如果酪氨酸激酶一直处于“活跃”状态，能引起细胞的不受抑制的生长，并抑制了细胞凋亡的发生，造成细胞生长失控，最终导致慢性粒细胞白血病的发生。

图三格列卫的发现

BCR-ABL融合基因编码的异常酪氨酸激酶致癌机制在年被发现后，瑞士Ciba-Geigy制药公司的研究员尼古拉斯·B.莱登与俄勒冈健康与科学大学的布莱恩·J.德鲁克尔等人合作研发抗肿瘤药物，他们通过高通量筛选技术，找到了2-苯胺基嘧啶，它可以与BCR-ABL蛋白上的活性位置结合，抑制其活性。研究者通过对2-苯胺基嘧啶进行甲基和苯甲酰胺等修饰以增加其药性，最终得到了伊马替尼，也就是格列卫。

图四已上市的TKIs

格列卫的出现开启了肿瘤靶向治疗的先河，然而随着用药时间的延长，出现了耐药性问题，其中之一的变异是苏氨酸（T）变异成了异亮氨酸（TI），仅有帕纳替尼能够对此变异的BCR-ABL产生效应，但由于其脱靶效应导致治疗剂量受限。目前上市的TKIs主要分为两类：TypeI和TypeII，其中TypeI的作用机制是在TK活性构象下（DFGin），结合在ATP结合口袋，而TypeII则是在TK的非活性构象下（DFGout），结合在ATP结合口袋。除此之外还有其他类型的TKIs，其主要特征是结合位点并非ATP结合口袋，如变构抑制等。

图五A，非活性组合状态下的ABL激酶，肉豆蔻酰与TypeI类激酶抑制剂PD的共晶结构。B，伊马替尼与ABL1SH1domin共晶结构。注意到这两个不同构型中的helix-I的构象差异，非活性状态（A）中以弯折状态存在，而在无自调节机制中则以线性部分无序状态存在。

年，Kuriyan和SupertiFurga在Cell上发表了关于ABL1以及ABL2激酶的自调节机理，肉豆蔻酸通过与ABL激酶C-lobe端的肉豆蔻酰结合口袋处以共价键方式结合，诱导激酶处于一种非活性构象状态，然而在BCR-ABL融合体中，由于BCR基因编码的序列替代了正常肉豆蔻酰结合口袋处的含N序列，致使ABL失去了自调节功能，长期处于激活状态。肉豆蔻酰的调剂机制与TypeII型的抑制剂机制不同，typeII抑制剂是结合在DFG-out状态下的ATP结合位点，稳定非活性构象状态，而肉豆蔻酰则是结合在远离ATP结合位点的位置，以此结合位点开发新型抑制剂，理论上可以得到选择性更好的化合物，因为ATP结合位点的序列是高度保守的，而远端的调节序列则存在很明显的差异性。

图六新型ABL-BCR抑制剂

Adrian和同事们采用BCR-ABL1依赖性的鼠源造血干细胞系，通过表型筛选得到了N-phenylpyrimidin-4-amine类的新型抑制剂GNF-2，SAR研究表明对位的三氟甲氧基、NHlinker是活性必须部分，后续经NMR以及X-ray衍射证实，GNF-2结合在ABL的肉豆蔻酸结合口袋处，变构抑制ABL激酶的活性，然而对于此系列的Lead，目前还未产生任何进入临床阶段的化合物。

图七ABL开发历程

Novartis的研发人员根据上述的发现，将ABL激酶用伊马替尼封闭ATP结合位点后，采用FBBD开发策略，结合NMR分析得到了一系列具有较好结合性的碎片分子，如2和3，然而其均无活性。另外，基于碎片分子与通过分子类似性、药效团搜索以及分子对接技术得到的hit4，虽然显示有较好的结合性，但是仍然无活性。在对开发方法进行回顾分析时，发现因为蛋白共晶结构中只能显示出ABL激酶的激酶domain，关键的肉豆蔻酸结合口袋helix-I不可见，因此虽然能够观察到碎片分子与变构位结合，但其具体的结合效果并不可知，因为变构调节作用是通过诱导helix-I由线性构象转化为弯曲构象实现的。

图八氮同位素标记NMR分析原理

在弄清楚所得hit仅有结合性而无活性的原因后，研发人员调整了筛选方式，采用含氮同位素标记的V（缬氨酸）ABL在溶液中与待测物用N-H二维NMR分析，因为15N,1H-HSQC在Helix-I弯曲/线性构象下的响应不同，可以很清楚的观察到所测化合物是否能够有效的产生变构效应，以此方法分析化合物4以及其他得到的碎片分子，观察到明显的NMR响应，而肉豆蔻酸以及GNF-2均未发现强响应，证明了此方法是可靠的。此外，借鉴GNF-2的SAR数据，引入对三氟甲氧基苯胺结构，经过初步的结构修饰得到lead，最终经过不断的优化，得到理想的BCR-ABL临床化合物ABL。